分析和转化基因组学
分析和转化基因组学 (ATG) 共享资源为 UNM 癌症中心成员和 UNM 及附属机构的其他用户提供下一代测序和其他基因组学相关服务。 主要服务涉及下一代测序，使用两台 Ion Proton S5/XL 仪器，以及相关的专家生物信息学支持。 其中包括常规“批量”RNA-seq、使用 10x Genomics 系统的单细胞 RNA-seq、靶向 DNA 测序、ChIP-seq 和各种其他测定，其中许多可以使用活细胞或冷冻细胞或组织进行或存档（例如 FFPE）样本。 Singular Genomics G4 测序仪以灵活快速的方式提供下一代测序，适用于所有类型的 RNA-seq 和 DNA-seq 分析。 Ion Proton S5/XL 仪器特别适用于分析质量较差的 RNA，例如来自 FFPE 材料的 RNA，使用其他技术很难或不可能对其进行分析。 这些仪器每个测序芯片产生多达 100 亿个读数，如果可能，我们努力提供快速周转。
共享资源得到了 UNM 癌症中心的支持，包括 CCSG 核心拨款 P30CA118100 和其他资金，以及来自新墨西哥州的资金和用户费用。
专家人员可以进行咨询，以帮助用户设计尽可能最好的实验，以最大限度地提高产生的数据的质量。
分析和转化基因组学
ATG 可供 UNM 和附属机构的所有研究人员使用。
要确认使用此共享资源，请在您的出版物中包含以下内容：
这项研究得到了 UNM 综合癌症中心支持赠款 NCI P30CA118100 的部分支持，并利用了分析和转化基因组学共享资源，该资源得到了新墨西哥州的额外支持。
ATG 服务将在下面更详细地描述。
分析和转化基因组学资源 主要提供下一代测序技术，如 RNA-seq、靶向基因 panel 测序和表观遗传学分析，如 ChIP-seq 和 ATAC-seq，以及专家生物信息学分析。 还提供实时 PCR 服务。 ATG 共享资源可供 UNM 及其附属机构的所有教职员工使用，鼓励所有研究人员与我们联系，了解我们如何帮助他们进行研究。
10x 基因组学单细胞测序： 使用 10x Genomics 系统提供尖端的单细胞测序，该系统适用于活细胞或冷冻样品中的分离细胞核。
Singular Genomics G4 双端测序： 一种灵活快速的测序仪器，适用于所有类型的下一代测序，包括 RNA-seq、ChIP-seq、全外显子组测序 (WES) 或全基因组测序 (WGS)。 大多数为 Illumina 测序准备的文库都可以快速高效地转换，以便在 G4 上进行分析。
Illumina测序： ATG 与 Univ of CO, Anschutz 的 Genomics Core 签订了使用他们的 NovaSeq 仪器进行 Illumina 测序的合同。 ATG 可以准备文库并将它们运送到 UofCO 进行测序，或将样品运送到那里进行文库准备和测序。 之后，将数据上传到我们的 AWS 网络账户进行数据分析。
Ion Torrent 下一代测序： 功能强大的 Life Technologies Ion Proton S5/XL 半导体测序仪器是下一代测序分析的理想选择，包括癌症的基因表达 (RNA-seq) 分析、表观遗传学分析 (ChIP-seq) 和靶向测序（Ion Ampliseq Comprehensive Cancer Panel）——相关基因，甚至来自 FFPE 样本。
专家生物信息学数据分析： ATG Shared Resource 工作人员使用复杂的数据分析方法来分析基因表达和基因分型数据，并努力为我们的用户提供其手稿或拨款申请的出版质量数据。 我们使用 R/Bioconductor 软件包来探索由基因组学方法生成的庞大而复杂的数据集。
下一代测序的应用
下一代（大规模并行）测序可用于各种实验方法。 它不能替代质粒或 PCR 产物的正常 (Sanger) 测序。 相反，下一代测序依赖于捕获数百万或数十亿个单独的 DNA 分子（例如基因组 DNA 片段、cDNA），然后单独扩增并并行测序，生成数百万或数十亿个测序“读数”，每个读数都源自不同的模板分子。 它类似于单独克隆和测序数百万或数十亿个独立的 DNA 片段，但这一切都是在短短几天内发生的。
以下类型的科学应用很容易适应下一代测序方法：
- 癌症或疾病相关基因的靶向基因组测序
- 使用 RNA-seq 进行基因表达研究
- 染色质免疫沉淀 - 用于转录因子或表观遗传研究的测序 (ChIP-seq)
- DNA甲基化研究（例如RRBS）
- 转录组测序（例如，选择性加香料的 RNA 的鉴定）
- 分析非编码 RNA（ncRNA、lincRNA、miR）
ATG 设施目前拥有或可以使用多种类型的下一代测序仪器：
- 奇异基因组学 G4： 快速灵活的双端测序（类似于 Illumina NextSeq）
- ThermoFisher 离子 S5/XL： 固态 NGS 每个芯片产生高达 120 亿次读取
- Illumina测序 （NovaSeq 和 NextSeq）通过我们在 Univ of CO, Anschutz 的合作伙伴
- 10x Genomics Chromium 控制器： 用于单细胞 RNA-seq 和 ATAC-seq 测定
这些仪器为所有类型的下一代测序分析提供具有成本效益和快速的下一代测序。
周一至周五上午 8:30 至下午 5 点提供共享乐器
（其他时间可根据特殊安排提供）
ATG 有几种独特的仪器可供 UNM 研究人员安排使用。 合格的实验室每年支付用户费用并接受 ATG 员工的培训和支持。 这些仪器可在正常工作时间内在设施中使用。
安捷伦生物分析仪： 分子生物学家的重要仪器，在许多类型的应用中取代了凝胶电泳。 它对于使用非常少量的材料分析 RNA 或 DNA 样品的质量和/或数量特别有用，而不是在凝胶上运行大量珍贵的样品。
Nanodrop分光光度计： 一种液滴分光光度计，可测量一小滴样品的吸光度。 这避免了将样品稀释到大比色皿中的需要。
赛默飞世尔细胞 Coutess II： 用于量化样品中的活细胞。
Milteny gentleMACS Octo 解离器带加热器： 用于在测序前解离组织样本。
量子位荧光计： 用于定量 RNA 和 DNA
有关化验和定价的更多信息，请联系 ATG 设施工作人员。
填写 这个 smartsheet 表单 开始您的项目。
（表单将在新选项卡中打开。如果没有，请将此文本复制并粘贴到浏览器中新选项卡的地址栏中： https://app.smartsheet.com/b/form/fa518ed260454445bec9d3bc34cac4cf)
ATG 常见问题
这些是考虑使用 ATG 共享资源中的下一代测序 (NGS) 服务的研究人员的指南。 敦促所有研究人员在开始准备或分析样品之前咨询 ATG 工作人员。 我们可以协助进行实验设计，并在必要时让您与可以帮助进行实验设计的专业生物统计学家取得联系。 在开始 NGS 实验之前考虑实验设计非常重要，这可能非常昂贵。
RNA-seq 可以用非常少量的 RNA 成功执行。 然而，所需的量取决于所需的“读取深度”以及是否会有核糖体 RNA 污染。 核糖体 RNA 是细胞中 90% 的 RNA，因此在进行 RNA-seq 之前有必要去除或减少核糖体 RNA。 两种方法是物理去除，通过“核糖体去除”，其中与核糖体 RNA 互补的生物素化探针与 RNA 样品杂交，然后捕获并去除复合物。 或者，可以使用 poly-A 导向的文库制备方法（例如 Smart-Seq），避免对核糖体 RNA 进行测序，但排除其他缺乏 polyA 尾和可能感兴趣的 RNA（例如 microRNA）。 请在开始实验之前联系 ATG 共享资源工作人员讨论选项。
ATG 共享资源执行全服务 NGS 分析。 然而，由于 NGS 文库制备的复杂性，ATG 能提供什么取决于实验的类型。 对于靶向面板测序和外显子组测序，我们只需要 DNA 样本，我们将生成文库、执行测序和初步分析。 在开始工作之前，我们将提供预期成本的报价。 对于 RNA-seq 和其他方法，构建文库的方式有很多变化。 我们敦促用户在开始之前联系 ATG 工作人员讨论选项。 除了完整的 Affymetrix 系统外，ATG Shared Resource 还具有用于定量小体积 RNA 的 Nanodrop 光谱仪和用于快速分析 RNA 或 DNA 样品的质量和数量的安捷伦生物分析仪。
NGS 实验可能很昂贵。 大多数大型实验（外显子组测序、RNA-seq 等）的总成本为每个样本 500 至 800 美元，外加生物信息学费用。 一些较小的靶向测序实验每个样本的成本较低。 请联系工作人员了解更多信息并获取报价。
是的！ NGS 实验会生成大型、复杂的数据集。 没有重复就不可能进行生物信息学分析。 三联更好。 为了获得有意义且值得付出代价的好结果，重复确实是必要的。
ATG 共享资源遵循严格的质量控制指南和标准操作程序，以确保数据具有最高质量，并达到或超过 ENCODE 联盟等团体设定的标准。 我们使用标准的掺入控制来监控内部流程并在文库生产和测序的每个阶段执行质量控制检查。 请联系 ATG 工作人员查看我们成功生成的数据示例。
起始 RNA 样品的质量将使用安捷伦生物分析仪或实时 PCR 进行确认。 在测序之前将类似地检查库。 在几个步骤中添加了掺入控制以监控内部质量控制。
NGS 分析产生包含大量信息的大型复杂数据集，但也可能难以分析。 ATG 共享资源提供第一级分析，包括质量控制参数分析、读数与适当基因组的比对、识别序列变异或特征计数（视情况而定）以及执行直接类型的解释，例如生成热图用于 RNA 序列。 但是，更复杂的数据分析类型，例如将结果与患者信息相关联，应在来自生物信息学共享资源或生物统计共享资源的专家的输入下进行。 ATG 工作人员可以帮助与合适的专家建立互动，他们应该从一开始就参与帮助实验设计和质量控制。
生成 NGS 数据所涉及的复杂过程可能会产生“日间效应”或“批次效应”，即在同一数据集群上处理或分析的样本聚集在一起。 这是众所周知的高维数据分析神器，我们包含了spike-in 控件来帮助我们识别和消除这些类型的数据问题。
ATG 共享资源拥有一个由生物信息学专家组成的团队，他们将执行初始数据分析以及管理和备份数据。 他们可以执行最直接的分析类型（例如来自 RNA-seq 的基因表达）。 但是，复杂或定制类型的分析需要来自生物统计学或生物信息学共享资源的其他专家的投入。 ATG 员工可以帮助建立所需的协作。
验证是每个NGS实验的重要组成部分，要求因实验类型而异。 请联系 ATG 工作人员讨论验证 NGS 结果的选项。
设施主任， Scott A. Ness，博士., 可以提供关于如何在拨款申请中描述 ATG 共享资源和潜在 NGS 实验的支持信和建议。 Ness 博士曾在众多 NIH、ACS 和 DOD 研究部门任职，并审查了许多包括 NGS 实验在内的拨款申请。 他自己资助的赠款在其中进行了 NGS 实验。 他可以帮助您撰写有关 NGS 实验的资助部分，并可以指出潜在的陷阱和要避免的事情。
批评 NGS 实验的最简单方法是将其描述为一次钓鱼探险。 这里有一些你绝对应该避免的事情。
- 不要提议对您尚未确定的基因进行表征。 如果您没有初步数据，您不知道会找到哪些基因或多少基因。 但是，它们的数量可能会达到数百个。 简单地说，您将选择一些有趣的基因进行研究，这是一种快速获得低分的方法。 如果可能，你的实验应该检验一个假设。 例如，您可以假设某些基因（例如凋亡基因）会被诱导。 然后您可以建议使用 NGS 检测来测试（并建议使用实时 PCR 作为备用方法）。 这样你就可以测试一个假设，提出预期的结果和控制（例如应该上升和下降的基因），这是进行 NGS 实验（或任何其他实验）的更好方法。 简单地寻找基因是一种糟糕的方法，并且总是会引起审查委员会的愤怒。
- 简单地说您将使用一些软件程序来分析数据或将基因分组到通路中也会给您带来麻烦。 NGS 数据可能极其复杂，需要使用统计方法进行分析。 已知的通路数据非常不完整。 无论如何，大多数基因都不在通路中。您需要一个精心策划的方法来分析数据。 你应该有办法判断实验是否成功（例如，预期的凋亡基因是否被激活？）。
- NGS 实验不应该只是您目标之一末尾的一段话。 无论你做什么，绝对不要在资助申请的末尾添加 NGS 实验，因为你“也会做”。 NGS 实验规模大、成本高且复杂，不能事后考虑。 很多很多的资助有一个 NGS 实验的一段描述，研究人员也会这样做。 这是评论家批评的避雷针。
- 如果你正在寻找基因，你应该寻找它们是有原因的。 不要只是提议寻找受调控的基因而不提议对它们做些什么。 找到上下波动的基因并不是一个足够重要的目标。 您需要在寻找具有某种目的的基因（例如要测试的某些假设）。